Донской ставропигиальный мужской монастырь – это древняя обитель, которую справедливо можно назвать хранительницей богатейшего собрания святынь и церковных реликвий. Частицы святых мощей, чудотворные иконы, уникальная коллекция древностей являются достоянием благодатной обители. Однако, одной из главных святынь Донского монастыря по праву считается Донская икона Божией Матери, которая была написана в XVI веке («древнейшего письма московского») и установлена в Большом соборе в местном ряду иконостаса.
Автором Донской иконы Пресвятой Богоматери считается преподобный Феофан Грек. По преданию, 8 сентября 1380 года в день великой Куликовской битвы (на праздник Рождества Пресвятой Богоматери) икона вдохновляла русских воинов на победу, находясь среди войска, а после победоносного сражения была преподнесена донскими казаками в дар князю Димитрию (прозванному затем Донским), который в память славной победы на Дону нарек ее Донской и перенес в Москву. Поначалу икона находилась в Успенском, а затем была перенесена в Благовещенский собор. Ныне же святыня хранится в Государственной Третьяковской галерее.
По сложившейся традиции каждый год 1 сентября (по ст. стилю 19 августа), в день чествования Донской иконы Божией Матери ее доставляют из Государственной Третьяковской галереи в Донской монастырь, где пред этой древней святыней Святейший Патриарх при огромном стечении богомольцев из Москвы и других городов России и зарубежья совершает Божественную литургию.
Другой духовной жемчужиной Донской обители являются святые мощи святителя Тихона, Патриарха Всероссийского, почивающие в серебряной раке в Большом соборе монастыря.
В начале 1992 года в Малом соборе был совершен поджог, в результате чего выгорела практически вся трапезная часть храма. При восстановительных работах после пожара практически случайно были обнаружены мощи святителя Тихона, Патриарха Всероссийского, похороненного здесь в 1925 году. Находка стала настоящим чудом и еще одним свидетельством возрождения собора.
Незадолго до обретения мощей, в 1989 году, Русская Православная Церковь канонизировала патриарха Тихона и причислила его к лику святых. Также среди главных святынь Малого собора – чтимые иконы Божией Матери «Феодоровская» и «Знамение», с ними соседствует список Донского образа Пресвятой Богородицы, украшенный особой сенью. В часовне-усыпальнице Левченко (начало XX века, архитектор И. Клейн) сохранилась мозаичная икона святителя Николая, а у стен Малого собора – могила мученика Якова Полозова, келейника святителя Тихона.